細胞傳代培養

根據細胞生長(cháng)的恃點(diǎn)，細胞傳代培養方法有3種：貼壁生長(cháng)細胞傳代、半懸浮生長(cháng)細胞傳代（Hela細胞）、懸浮生長(cháng)細胞傳代。

◆ 貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長(cháng)的細胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長(cháng)的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

實(shí)驗材料：細胞、D-Hanks液、胎牛血清、DMEM培養基 / RPMI1640培養基、Penicillin-Streptomycin（P/S雙抗）、胰蛋白酶

儀器與耗材：凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、培養箱、玻璃瓶、細胞培養瓶/皿、廢液缸、離心管、紅血球計數板、不同規格的移液器及其配套的無(wú)菌吸頭、吸管

1.  貼壁細胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶?jì)扰f培養液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶?jì)燃尤脒m量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面。（注意：胰蛋白酶要預溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5 min 后把培養瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數毫升，輕輕轉動(dòng)培養瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶?jì)扰囵B液，反復吹打瓶壁細胞。從培養瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)猛。 

7） 細胞計數后分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

8）置于37℃細胞培養箱培養。（注意：要定時(shí)觀(guān)察細胞，如發(fā)現污染，應及時(shí)處理。）

2.  懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細胞連同培養液一并轉移到15 ml 離心管內。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉速要合適。轉速過(guò)低，不能有效分離細胞；離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(cháng)，會(huì )擠壓細胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打形成細胞懸液。

4） 計數，分別接種在新的培養瓶?jì)取?/span>

 直接傳代法：

讓?xiě)腋〖毎恋碓谄康缀?，將上清液吸?/2~2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細胞，如Hela細胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。
2）對絕大部分貼壁生長(cháng)的細胞，因直接吹打對細胞損傷較大，細胞常有較大數量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。