原代細胞分離培養有哪些注意事項？

　　1、組織塊培養法

　?。?）接種后的前3天，觀(guān)察和移動(dòng)時(shí)注意不要引起液體振蕩。避免頻繁的翻倒和振動(dòng)，否則組織塊不易附著(zhù)在瓶壁上或附著(zhù)后脫落飄浮。

　?。?）加入的培養基不宜過(guò)多，以免浸泡的組織因輕微波動(dòng)而脫落。

　?。?）細胞向外遷移時(shí)，注意記錄并清除漂浮的組織塊和殘留細胞。它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì )影響原代細胞的生長(cháng)。

　?。?）為促進(jìn)組織塊盡快貼在培養瓶上，可在種植前在培養瓶底壁涂上一層薄薄的膠原蛋白。

 

　　2、貼壁原代細胞

　?。?）原代細胞分離培養的分離細胞一次接觸體外環(huán)境時(shí)，會(huì )相互影響。這些細胞之間可以產(chǎn)生一些促生長(cháng)活性物質(zhì)，促進(jìn)細胞的存活和生長(cháng)。如果接種細胞的密度過(guò)低，細胞間的促生長(cháng)作用就很小，細胞分散后很難適應從體內組織環(huán)境到獨立生存環(huán)境的變化過(guò)程。如果接種的細胞密度過(guò)高，會(huì )導致?tīng)I養供給不足，代謝廢物迅速堆積，需要頻繁換液和通過(guò)。

　?。?）適當提高原代培養接種的細胞密度，為培養細胞提供更多與體內相似的細胞間相互作用，將大大提高原代培養細胞在體外的存活率。當細胞適應體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養時(shí)，以較低的密度進(jìn)行接種和培養。

　?。?）接種后的細胞盡快貼壁是培養成功的關(guān)鍵。接種后可將培養瓶放入培養箱中培養3h～5h。待細胞貼壁后，可補充培養基繼續培養。

　　3、懸浮型原代細胞

　?。?）原代細胞分離培養細胞必須保持懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養基的粘度來(lái)懸浮細胞，例如在培養基中加入低濃度的透明質(zhì)酸復合物。將培養基加入帶攪拌裝置的培養容器中，最少5ml，否則攪拌時(shí)會(huì )產(chǎn)生氣泡，對細胞造成損傷。這種方式要注意攪拌速度不要太快，否則培養基會(huì )溢出，容易造成污染。如果培養基的量小于5ml，可以使用旋轉瓶進(jìn)行培養。更換懸浮培養細胞溶液時(shí)，注意不要吸出細胞。

　?。?）可懸浮培養的細胞一般活力強，體外分裂增殖快，營(yíng)養物質(zhì)消耗大，換液時(shí)間間隔短。